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Myo Inositol während der ivf bei der Implantation

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Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion auf jedem Medium ermöglicht, sofern das Originalwerk ordnungsgemäß zitiert wird. Myo-Inositol-Myo-Ins spielt eine physiologische Rolle bei der Gametogenese und Embryonalentwicklung von Säugetieren und hat einen positiven klinischen Einfluss auf die medizinisch unterstützte Reproduktion des Menschen.

Wir haben zuvor gezeigt, dass die Exposition von Mausembryonen gegenüber Myo-Ins durch Präimplantationsentwicklung in vitro die Proliferationsaktivität und die Blastozystenproduktion erhöht, was eine Verbesserung der Kulturbedingungen darstellt. Parallel dazu wurden Embryonen im Blastozystenstadium in pseudopregnante Frauen übertragen und konnten sich bis zum Ende und bis zum Absetzen entwickeln. Die erhaltenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass Myo-Ins Zellwege induziert, an denen Akt beteiligt ist, und zeigen, dass eine Exposition von Präimplantationsembryonen gegenüber Myo-Ins die Anzahl der für den Uterustransfer verfügbaren Blastozysten und der abgegebenen Tiere sowie die Entwicklungsmuster von Mäusen erhöht, die aus in kultivierten Embryonen gewonnen wurden Das Vorhandensein oder Fehlen von Myo-Ins im Alter von bis zu drei Wochen überschneidet sich.

Diese Daten identifizieren Myo-Ins weiter als eine möglicherweise wichtige Ergänzung für die Embryokultur vor der Implantation beim Menschen in der assistierten Reproduktionstechnologie. Myo-Inositol-Myo-Ins ist der Hauptbestandteil einer Familie von neun Hexahydroxycyclohexan-Inositol-Ins-Stereoisomeren, die in eukaryotischen Geweben und Zellen weit verbreitet sind und an grundlegenden biologischen Funktionen beteiligt sind [1].

Ins wird als Phosphatidyl-Inositol-PI in Zellmembran-Phosphoinositide oder Phosphatidyl-Glyceride eingebaut, das durch einen Satz spezifischer Phosphoinositid-3-Kinasen PI3K zu Phosphatidyl-Inosit-Phosphaten phosphoryliert wird. Inosit ist der Vorläufer anderer Membrankomponenten und Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol-GPI-Protein-Ankermoleküle, die von [4] überprüft wurden, Signalmolekülen, die von [5, 6] überprüft wurden, Chromatin-Remodelling und transkriptionsmodulierende Moleküle [7]. Es wirkt schließlich als hyperosmotischer Stressschutz [8].

Zunehmende Evidenz zeigt, dass Myo-Ins eine physiologische Rolle bei der Gametogenese und Embryonalentwicklung von Säugetieren spielt und einen positiven klinischen Einfluss auf die medizinisch unterstützte Reproduktion des Menschen hat. Myo-Ins fungiert zusammen mit seinem Isomer D-Chiro-Inositol-D-Chiro-Ins als zweiter Botenstoff für Insulin [9] und wurde umfassend auf seine Beteiligung am metabolischen Syndrom untersucht, das von [10] überprüft wurde, sowie für die Behandlung von PCOS (polyzystisches Ovarialsyndrom), überprüft von [11, 12], einer der häufigsten endokrinen Erkrankungen bei Frauen [13], die eng mit Insulinresistenz assoziiert sind [14].

Jüngste Berichte deuten stark darauf hin, dass beide Ins-Isomere bei der Behandlung von PCOS-Patienten, die an Verfahren zur assistierten Reproduktion teilnehmen, positiv assoziiert sein können [15], was signifikante ermutigende klinische Ergebnisse liefert [16]. Während D-Chiro-Ins keine klare Rolle im Eierstock oder im Hoden zu spielen scheint, beeinflusst Myo-Ins die gametogenetischen und embryogenetischen Prozesse auf mehreren Ebenen und spielt eine schützende, positive Rolle bei der Reproduktion und Entwicklung, die von [17] überprüft wurde.

Die Myo-Ins-Konzentration im Fortpflanzungstrakt männlicher Säugetiere ist höher als im Blutserum, das von FSH-responsiven Sertoli-Zellen produziert wird [18, 19]. Studien an pathologischen Spermienproben haben gezeigt, dass Myo-Ins für die Spermatogenese von entscheidender Bedeutung sind, indem sie die Motilität der Spermien [20] und das Mitochondrienmembranpotential [21], einen apoptotischen Marker, der direkt mit der Lebensfähigkeit der Zellen zusammenhängt, positiv beeinflussen. Da diese Parameter Prädiktoren für eine gute Embryonenqualität sind, wird die Verwendung von Myo-Ins im andrologischen Labor eingesetzt, um die Erholung von Spermien nach dem Aufschwimmen in IVF-Zyklen mit In-vitro-Fertilisation zu verbessern [20].

Was die weibliche Gametogenese betrifft, so ist myo-Ins aktiv in der Follikel- und Tubenflüssigkeit von Säugetieren konzentriert und höher als im Blutserum [22].

Darüber hinaus besteht eine positive Korrelation zwischen dem Gehalt an follikulären Myo-Ins und der Eizellenqualität sowie dem Schwangerschaftsergebnis [23]. Auf der Ebene der Eierstöcke hat Myo-Ins unterschiedliche Funktionen sowohl in Follikelzellen als auch in Eizellen. Obwohl bekannt ist, dass der Myo-Ins-Metabolismus in Follikelzellen von PCOS-Patienten stark dereguliert ist [25], müssen die Auswirkungen dieses Moleküls auf somatische Ovarialzellen noch untersucht werden.

Wir haben angenommen, dass Myo-Ins in Theca- und Granulosazellen die steroidogene Aktivität während des Ovarialzyklus aufrechterhalten können, indem sie die Dynamik der Zytoskelettstrukturen modulieren [26]. In unseren Labors wird derzeit an diesem Thema geforscht. Myo-Ins wird von einem Natrium-Cotransporter [27] und einem natriumunabhängigen Transporter [28] in Säugetierzellen transportiert, einschließlich wachsender und ausgewachsener Eizellen und Embryo-Blastomere vor der Implantation. Es wirkt über die zellspezifischen Rezeptoren InsP3-R1 [31] und scheint eine Schlüsselrolle bei der meiotischen Reifung zu spielen [32].

Chiu et al. Nach der Übertragung auf Pflegemütter waren die Implantationsrate und die Lebensfähigkeit dieser Embryonen nach der Implantation auch in den mit Myo-Ins behandelten Gruppen erhöht [33]. Während der Präimplantationsentwicklung bei Säugetieren sorgt die Aktivität von Myo-Ins-Transportern für eine robuste Aufnahme, die vom Einzell- zum Blastozystenstadium progressiv zunimmt [34, 35], was auf einen parallelen Anstieg des Zellbedarfs des Moleküls hindeutet.

Es wurde gezeigt, dass Myo-Ins in Embryo-Blastomeren vor der Implantation schnell in Phosphoinositide eingebaut werden [34], was zu erhöhten intrazellulären InsP3-Spiegeln führt.

Dies veranlasste mehrere Gruppen, einschließlich unserer, zu untersuchen, ob Myo-Ins auch während der Präimplantationsentwicklung sowohl bei Labormäusen als auch bei landwirtschaftlichen Arten eine positive Wirkung haben könnten. Es wurde festgestellt, dass eine Myo-Ins-Ergänzung von Kulturmedien die Bildung und Expansion von Blastozysten bei Kaninchen und Rindern verbessert [35, 36]. Ähnliche Beobachtungen wurden an in vitro gereiften und befruchteten Rinderzygoten [36] nach Kultivierung in synthetischem Medium für Eileiterflüssigkeit [37] in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 erhalten.

Infolgedessen war die Blastozystenrate bei Embryonen, die in Gegenwart von Myo-Ins entwickelt wurden, höher [36]. Um die Auswirkungen dieser Behandlung nach der Implantation zu bewerten, wurden zehn in Gegenwart von Myo-Ins gezüchtete Blastozysten auf Pflegekühe übertragen und termingerecht entwickelt, wobei fünf gesunde Tiere erzeugt wurden [36].

Wir haben diese Hypothese in einer früheren Arbeit [38] unter Verwendung des Mausembryomodells [39, 40] getestet, indem wir die Auswirkungen der Myo-Ins-Supplementierung von sequentiellen menschlichen Embryokulturmedien ab 30 Minuten nach der Befruchtung untersucht haben. In allen überwachten Zeitintervallen, p. Bei diesen Embryonen traten frühe Differenzierungsereignisse wie Verdichtung und Blastulation im richtigen Entwicklungsstadium auf, wobei offensichtliche toxische Wirkungen von Myo-Ins ausgeschlossen wurden. Obwohl die am 4. Tag erzielten Ergebnisse bereits veröffentlicht wurden [38], wurden die zu Zwischenzeiten aufgezeichneten Ergebnisse nicht an anderer Stelle vorgestellt und sind in den Abbildungen 1 und 2 zusammen mit der am 4. Tag beobachteten Embryonenmorphologie angegeben.

Embryonen, die in Gegenwart von Myo-Ins kultiviert wurden, waren in Bezug auf Kontrollembryonen entwicklungsbedingt fortgeschritten und wurden hauptsächlich durch expandierte Blastozysten mit einer höheren Anzahl von Blastomeren dargestellt, wie durch die Kernfärbung nach Hoechst 33343 gezeigt [38].

Wir kamen zu dem Schluss, dass die Myo-Ins-Supplementierung eine Verbesserung der Kulturbedingungen darstellt, wodurch die Entwicklungslücke verringert wird, die typischerweise zwischen in vitro erhaltenen und kultivierten Embryonen und in vivo entwickelten Embryonen beobachtet wird, was die mögliche Verwendung für die Präimplantationskultur menschlicher Embryonen weiter unterstützt.

Eines der Probleme, die bei diesen Experimenten aufgedeckt wurden, betrifft die Art der biochemischen Wege, die durch die Exposition gegenüber Myo-Ins bei der Präimplantation von Embryo-Blastomeren induziert werden. Vorhandene Informationen legen nahe, dass mögliche Wege, die durch Myo-Ins in Mausembryo-Blastomeren ausgelöst werden und für eine verringerte Länge der Zellzyklen und eine effizientere Proliferationsaktivität verantwortlich sind, durch den schnellen Einbau in Phosphoinositide [34] initiiert werden, nämlich PIP3, das durch Aktivität enzymatisch gefördert wird von PI3K.

Da gezeigt wurde, dass Myo-Ins die Akt-Phosphorylierung und damit die Aktivität in Skelettmuskelzellen von Mäusen erhöht [46], stellten wir die Hypothese auf, dass ein kritischer Schritt zur Verbesserung der Entwicklung der Embryo-Präimplantation durch die durch Myo-Ins-Supplementierung induzierte Akt-Aktivierung dargestellt werden könnte [47]. .

Ein zweites offenes Thema in der aktuellen Forschung betrifft die Sicherheit der Exposition von Embryonen vor der Implantation gegenüber Myo-Ins für die Postimplantation und die postnatale Entwicklung. Neben den berichteten Beobachtungen an Rinderembryonen [36] könnte argumentiert werden, dass Präimplantationsembryonen, einschließlich menschlicher Embryonen, früher routinemäßig in undefinierten Medien kultiviert wurden, die mit kommerziellen BSA-Präparaten oder Chargen von Rindern oder menschlichen Seren ergänzt waren, die unterschiedliche Mengen an Myo- enthielten Inosit, ohne offensichtliche negative Auswirkungen zu melden.

Darüber hinaus scheinen myo-Ins wichtig für die normale Entwicklung zu sein, die von [17] überprüft wurde. Seine Konzentration im fetalen Humanserum ist um ein Vielfaches höher als bei Erwachsenen und sinkt nur um die Geburt [48]. Seine Verabreichung während der Schwangerschaft hat positive Auswirkungen auf die pathologischen Zustände sowohl beim Menschen [49, 50] als auch bei Nagetieren [51 - 54].

Alle bisher gemeldeten Daten deuten darauf hin, dass die Exposition von Embryonen vor der Implantation gegenüber Myo-Ins keine nachteiligen Auswirkungen auf die weitere Entwicklung haben würde. Um direktere Informationen zu diesem Thema zu erhalten, haben wir in vitro produzierte Blastozysten, die in Gegenwart von Myo-Ins hergestellt wurden, in Pflegemütter des Empfängers übertragen und deren Entwicklung beenden lassen. Durch diesen Ansatz erhielten wir gesunde Nachkommen, die im Geschlechterverhältnis normal und zumindest bis zum Absetzen somatometrisch erschienen.

Diese Experimente liefern zusätzliche Daten zu Myo-Ins-Effekten auf Säugetier-Präimplantationsembryonen und legen nahe, dass dies als sicher für die Embryonalentwicklung angesehen werden kann.

Versuchsprotokolle und verwandte Verfahren wurden vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt. Nach der Paarung mit männlichen Mäusen ON wurden Frauen, die einen Vaginalpfropfen trugen, durch Genickbruch getötet und Cumulus-Oozyten-Komplexe aus den Eileitern gesammelt, die durch Behandlung mit 0 von Cumuluszellen befreit wurden.

Einzellige Embryonen wurden durch das Vorhandensein von zwei Vorkernen positiv bewertet und dann in zwei Gruppen unterteilt. Die Entwicklung von Embryonen wurde täglich auf Morphologie und Progression durch Spaltungsstadien untersucht. Präimplantationsembryonen im Morula- oder Blastozystenstadium wurden in 0 gewaschen. Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung eines Zeiss AxioPlan-Fluoreszenzmikroskops Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland, bei 400-facher Vergrößerung nachgewiesen.

Zur semiquantitativen Analyse der Fluoreszenz wurden Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien nach Pooling in denselben Tropfen immungefärbt.

Die Fluoreszenzemission wurde unter ähnlichen Anregungsbedingungen gesammelt und dann unter Verwendung der ImageJ-Software ImageJ 1 quantitativ analysiert. Am Tag der Entbindung wurden neugeborene Tiere gewogen, auf grobe Anomalien überprüft und bis zum Absetzen von ihren Müttern gepflegt. Die morphologischen Analysen vor dem Absetzen umfassten das Körperwachstum nach einer Woche, das Aussehen des Pelzes und die Augenöffnung.

Die Mäuse wurden schließlich im Alter von drei Wochen gewogen und geschlechtlich behandelt. Sofern nicht anders angegeben, wurden Chemikalien von Sigma-Aldrich Co. gekauft. Statistische Analysen wurden unter Verwendung von R: Eine Sprache und Umgebung für statistische Berechnungen durchgeführt. R-Entwicklungsteam, R-Grundlage für statistische Berechnungen, ISBN 3-900051-07-0, 2008, Wien, Österreich.

Wir haben das Vorhandensein und die Phosphorylierung von Akt in Embryonen im späten Präimplantationsstadium, die in Gegenwart oder Abwesenheit von Myo-Ins kultiviert wurden, durch Immunfluoreszenzanalyse bestimmt.

Dieser Ansatz zeigte das Vorhandensein von Serin 473- und Threonin 308-phosphoryliertem Akt sowohl in Morula- als auch in Blastozystenembryonen. Abbildung 3. Phosphoryliertes Akt war in Blastomerzytosolen prominent lokalisiert, es wurde jedoch auch eine begrenzte Kernlokalisation beobachtet. Der relative Gehalt an phosphoryliertem Akt in den gleichen Stadien wurde auch durch Quantifizierung der Immunfluoreszenzdaten gemessen. Tabelle 1. Der Gehalt an Serin 473-phosphoryliertem Akt schien in Embryonen, die in Gegenwart von Myo-Ins im Morula-Stadium kultiviert wurden, nicht verändert zu sein. Abbildung 3 a, aber es war im Blastozystenstadium erhöht, Abbildung 3 c.

Im Gegenteil, der Gehalt an Threonin 308-phosphoryliertem Akt variierte nicht signifikant in Abhängigkeit von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Myo-Ins-Morulae ,, Abbildung 3 b; Blastozysten ,,, Abbildung 3 d. Die Beträge des Gesamtakts variierten nicht unter verschiedenen Bedingungen, die nicht gezeigt wurden. In zehn Wiederholungsexperimenten wurden alle Embryonen, die sich in vitro in Gegenwart oder Abwesenheit von Myo-Ins zum expandierten oder nicht expandierten Blastozystenstadium entwickelt hatten, auf Pflegemütter übertragen und konnten sich durch Geburt und bis zum Absetzen entwickeln.

Ein ähnlicher Unterschied wurde beobachtet, indem die Anzahl der befruchteten Eizellen mit der Anzahl der übertragenen Embryonen verglichen wurde. Die Gesamtergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Die somatometrische Entwicklung schien bei Mäusen beider Gruppen ähnlich zu sein, wobei das Körperfell und die Augenöffnung angemessen erfasst wurden. Schließlich waren die Gewichte im Alter von drei Wochen für Männer und Embryokulturbedingungen bei Männern ähnlich: Akt stellt einen wichtigen nachgeschalteten Effektor von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Adhäsionsrezeptoren dar, die das Überleben und die Proliferation von Zellen fördern können [56, 57] und ist unter anderem reguliert andere durch PIP3, das zweite Messenger-Produkt von PI3K, durch Rekrutierung von PDK1.

PDK1 induziert eine direkte Phosphorylierung an Threonin 308 [58] und scheint auch an der negativen Regulation der Phosphorylierung an Serin 473 durch direkte Bindung an diese hydrophobe Stelle beteiligt zu sein. PDK1 kann jedoch durch ein geeignetes Signal verdrängt werden [59, 60], einschließlich der Aktivierung von Integrin Like Kinase ILK [44], wodurch die Akt-Autophosphorylierung oder Phosphorylierung durch andere Kinasen am Serin 473 ermöglicht wird [58]. Dieser Weg macht die Akt-Phosphorylierung von Serin 473 durch vorgeschaltete Signale induzierbar; im Gegenteil, die Phosphorylierung von Threonin 308 scheint konstitutiv zu sein [56].

Wir haben zuvor gezeigt, dass während der ersten beiden Stadien der Embryonalentwicklung die Akt-Phosphorylierung nicht durch Hemmung von PI3K oder PDK1 verhindert wird, und sind zu dem Schluss gekommen, dass der Phosphorylierungszustand und die intrazelluläre Verteilung von Akt in zweizelligen Embryonen unabhängig von der Aktivität von sind beide Kinasen. Wir zeigen nun durch quantitative Immunfluoreszenzanalyse, dass die Serin 473-Phosphorylierung von Akt in späten Präimplantationsembryonen durch das Vorhandensein von Myo-Ins im Kulturmedium erhöht werden kann.

Es scheint daher, dass nach den anfänglichen Entwicklungsstadien eine neue Phosphorylierung von Akt in mittleren bis späten Präimplantationsstadien auftreten kann, abhängig von der Verfügbarkeit von Myo-Ins. Ein Anstieg der Phosphorylierung von Akt kann für die schnellere Entwicklungsrate von Embryonen verantwortlich sein, die in Gegenwart von Myo-Ins kultiviert wurden. Die mangelnde Induzierbarkeit der Threoninphosphorylierung von Akt durch myo-Ins stimmt ebenfalls mit früheren Beobachtungen überein [56]. Es ist rätselhaft, dass myo-Ins bei Zugabe zu Krebszellkulturen entgegengesetzte Wirkungen sowohl auf die PI3K- als auch auf die Akt-Aktivität ausübt [61], wobei festgestellt wurde, dass es die PI3K-Spiegel sowie die Akt-Aktivität durch Hemmung seiner Phosphorylierung senkt.

Um spezifischere Informationen über diesen Weg zu erhalten, analysieren wir derzeit die Auswirkungen von Myo-Ins sowohl auf die Entwicklung als auch auf die Akt-Phosphorylierung im Präimplantationsembryo in Gegenwart von Inhibitoren von PI3K und PDK1 [45]. Weitere Experimente werden sich mit der Beteiligung von Pro- und Anti-Apoptose-Faktoren der Bcl-2-Familie an der Proliferationsaktivität von Präimplantationsembryonen-Blastomeren befassen [62].

Die hier erstellten Daten stellen eine erste Einschätzung der Auswirkung der Exposition von Embryonen vor der Implantation gegenüber Myo-Ins auf die Mausentwicklung bis zum Ende dar. Bisher beschränken sich die Informationen zu diesem Thema bei Säugetieren auf einen Befund, der an in Gegenwart von 2 kultivierten Rinderembryonen erhalten wurde. In dieser Studie wurde kein Vergleich zwischen Embryonen durchgeführt, die unter den beiden Bedingungen kultiviert wurden, sondern Blastozysten, die sich nach Exposition gegenüber Myo vor der Implantation entwickelt hatten -Ins wurden übertragen, um gesunde Tiere zu produzieren.

Gegenwärtige Ergebnisse, die bei der Maus erhalten wurden, zeigen das offensichtliche Fehlen früher toxischer Wirkungen von Myo-Ins, wie dies durch eine normale pränatale und kurzfristige postnatale Entwicklung nahegelegt wird, und einen signifikanten Anstieg der Gesamtrate von Lebendgeburten, die nach einer Präimplantationsembryokultur in Myo erhalten wurden -Ins und anschließende Übertragung in Pflegemütter.

Wenn die erste Beobachtung angesichts der hier gemeldeten Informationen über die positiven Auswirkungen von myo-Ins auf die Gametogenese und Entwicklung von Säugetieren erwartet wurde, verdient die zweite besondere Aufmerksamkeit. Tatsächlich unterstützt es die Möglichkeit, dass eine regelmäßige Verwendung von myo-Ins als Kulturergänzung eine hohe Effizienz bei der Herstellung lebensfähiger Präimplantationsembryonen in vitro sowohl bei Mäusen als auch bei landwirtschaftlichen Arten mit vielversprechenden Ergebnissen für wissenschaftliche und wirtschaftliche Zwecke bietet.

Darüber hinaus wird die Hypothese gestärkt, dass die Verwendung von Myo-Ins eine ähnlich positive Rolle in der Kultur von in vitro hergestellten menschlichen Embryonen mit offensichtlichen medizinischen Konsequenzen spielen würde. Zu diesem Zweck sind jedoch mindestens auf drei verschiedenen Ebenen zusätzliche Bewertungen der Myo-Ins-Effekte erforderlich [63]: Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt hinsichtlich der Veröffentlichung dieses Papiers besteht.

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