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Wie man Puromycin-Stammlösungsberechnungen durchführt

Ampicillin-Natriumsalz: Tetracyclin HCl: Zellgefriermedium: Kollagenase IV: Schütteln Sie die Lösung vorsichtig hin und her, bis sich die Kollagenase aufgelöst hat.

Filtersterilisation mit einer 0. Aliquot in sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss. Arzneimittel zur Zellauswahl stellen Stammlösungen im Abzug her: Sigma, P8833-25MG: Sigma, H3274-50MG: Thermo, R21001: Blasticidin ist in Wasser und Essigsäure löslich.

ER Tracker Green: Bereiten Sie eine 1 mM Stammlösung vor, indem Sie den Inhalt des Fläschchens in 128 ul DMSO auflösen. Machen Sie Aliquots dieser 1 mM 1000x-Lösung und lagern Sie sie gefroren mit Trockenmittel. Verwenden Sie die geringstmöglichen Farbstoffkonzentrationen, um mögliche Markierungsartefakte zu minimieren. Entfernen Sie bei anhaftenden Zellen das Medium aus der Kulturschale, spülen Sie es mit HBSS ab und geben Sie eine vorgewärmte Färbelösung hinzu. Ersetzen Sie die Färbelösung durch frisches sondenfreies Medium und betrachten Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop.

So stellen Sie 1 Liter her: Filter Sterilisieren und bei Raumtemperatur lagern. Image-iT Green Caspase-Nachweis: Immunfluoreszenz-Färbepuffer: Filter sterilisieren durch 0. Bei 4 ° C lagern. So stellen Sie eine Stammlösung her: Lassen Sie das Produkt auf Raumtemperatur erwärmen und lagern Sie es bei -20 ° C. Löse 50 ug lyophilisierten Farbstoff, der in jedem Röhrchen enthalten ist, mit 94 ul hochwertigem wasserfreiem DMSO, um eine 1 mM Stammlösung zu erhalten.

Machen Sie Aliquots dieser 1 mM 1000x-Lösung und lagern Sie sie gefroren und lichtgeschützt. Die Konzentration der Sonde für eine optimale Färbung variiert je nach Anwendung. Allgemeine Richtlinien: Verwenden Sie Arbeitskonzentrationen von 25 bis 500 nM. Für die Färbung von Zellen, die fixiert und permeabilisiert werden sollen, siehe Fixierung und Permeabilisierung nach der Färbung, verwenden Sie eine Arbeitskonzentration von 100 - 500 nM.

Züchte Zellen auf Deckgläsern, füge eine vorgewärmte Färbelösung hinzu, die die Mito-Tracker-Sonde enthält, und inkubiere 15-45 Minuten. Mit vorgewärmtem Medium und Bild auffrischen.

Zur Behebung: Wir führen frisch sortierte Zellen in 0. Fügen Sie also zu einer neuen 500-ml-Flasche Medium 500 μl Normocin hinzu. Kühlen Sie ab und lagern Sie bei Raumtemperatur.

Beschichtete Platten können bis zur Verwendung bei Raumtemperatur verpackt und gelagert werden. Primer-Verdünnungen: Lyophilisierte Primer in TE bis zu einer Endkonzentration von 100 uM lösen. Primermischungen: Gründlich mischen, bis sie durch Schaukeln über Nacht bei 4 ° C aufgelöst sind.

Trypsininhibitor: Zurück zu den 480 ml D-PBS geben und mischen. Kollagen I-Beschichtung von Schalen: Phalloidin-Färbung: Zellen mit PBS waschen.

Behandle die Zellen mit 0. Wasche mit PBS. Bild sofort. Zur Langzeitlagerung an der Luft trocknen lassen. Subkultur spaltende Primärzellkulturen: Die Inkubationszeiten variieren typischerweise zwischen 5 und 10 Minuten bei Raumtemperatur. Während sich einige Zelltypen von der Platte gelöst haben, werden und müssen die meisten auch bei Raumtemperatur nicht mit Trypsin behandelt werden. Die Menge an Trypsin und die Zeit müssen ebenfalls empirisch bestimmt werden. Überwachen Sie sie daher genau durch Phasenmikroskopie. Die häufigsten Konzentrationen von Trypsin 0.

Ein leichtes Klopfen der Schale oder Pipettieren kann erforderlich sein, um die Zellen vollständig zu suspendieren. Sobald die Zellen ausgeschaltet sind und sich nicht in Klumpen befinden, sollten sie einzelne Zellen sein. Stoppen Sie das Trypsin, indem Sie mindestens ein gleiches Volumen von 0 hinzufügen. Jeder Zelltyp wird in diesem Stadium anders aussehen und es kann viele zusätzliche Ablagerungen geben.

Filtern Sie die Zellen durch einen 40-um-Filter, wenn sie nach FACS sortiert werden sollen. Zählen Sie die Zellen und zeichnen Sie ihr suspendiertes Volumen auf. Legen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen, verdünnen Sie sie mit PBS-Füllung auf 10-15 ml und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. 100-200 g reichen für kultivierte Zellen aus.

Die Zellen sind nun bereit, archiviert zu werden, in Zellgefriermedium resuspendiert oder wieder in kulturelles normales Wachstumsmedium gegeben zu werden. Kryoschnitte zur Gewebeimmunfärbung: Dissoziieren von Organoiden und Vorbereiten von Zellen für FACS: Link hier hinzufügen.

Immunmarkierungszellen für die FACS-Analyse: Tri-Lineage-Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen: Excel Sheet. Lentivirale Methoden Verpackung und Titration des Virus: Pflege und Reinigung des Zellinkubators: PDF- oder Thermo-Website. Protokolle Rezepte: Antibiotika für das Klonen von Bakterien: PDF Immunfluoreszenz-Färbepuffer: Kurzprotokolle: Zur Langzeitlagerung lufttrocken Subkultur spaltende Primärzellkulturen: Detaillierte Protokolle: Link hier hinzufügen Dreilinien-Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen: Excel Sheet Lentiviral Methods Verpackung und Titrationsvirus: Suche nach:

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