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Gephyrin, wo stehen wir jetzt?

Postsynaptische Gerüstproteine ​​regulieren die koordinierte Neurotransmission durch Verankerung und Clusterbildung von Rezeptoren und Adhäsionsmolekülen. Wir haben die Palmitoylierung auf Cys212 und Cys284 abgebildet, die sowohl für die Assoziation von Gephyrin mit der postsynaptischen Membran als auch für die Gephyrin-Clusterbildung entscheidend sind. Wir identifizierten DHHC-12 als die Hauptpalmitoylacyltransferase, die Gephyrin palmitoyliert.

Darüber hinaus potenzierte die Gephyrin-Pamitoylierung die GABAerge synaptische Übertragung, was durch eine erhöhte Amplitude von Miniatur-inhibitorischen postsynaptischen Strömen belegt wird.

Konsistent reduzierte die Hemmung der Gephyrin-Palmitoylierung entweder pharmakologisch oder durch Expression von Gephyrin mit Palmitoylierungsmangel die Größe des Gephyrin-Clusters. Eine effiziente Signalübertragung an Synapsen ist für höhere Gehirnfunktionen unerlässlich.

Wir zeigen, dass Gephyrin durch Palmitoylierung, eine reversible posttranslationale Fettsäuremodifikation, moduliert wird. Palmitoylierung erleichtert die Membranassoziation von Gephyrin und ist daher für die normale Clusterbildung von Gephyrin an GABAergen Synapsen wesentlich. Von den 23 bekannten Palmitoyltransferasen, die die Palmitoylierung von Proteinen in menschlichen Zellen katalysieren, haben wir ein Enzym, DHHC-12, identifiziert, um Gephyrin spezifisch zu modifizieren.

Unsere Ergebnisse bieten einen neuen Aspekt für die posttranslationale Kontrolle der synaptischen Plastizität. PLoS Biol 12 7: Akademischer Herausgeber: Matthew B. 18. März 2014; Akzeptiert: 5. Juni 2014; Veröffentlicht: 15. Juli 2014. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License verbreitet wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion auf jedem Medium ermöglicht, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben sind.

Datenverfügbarkeit: Die Autoren bestätigen, dass alle den Ergebnissen zugrunde liegenden Daten uneingeschränkt verfügbar sind. Alle relevanten Daten befinden sich im Papier und in den Hintergrundinformationen. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerfassung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts. Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Eine geregelte Signalübertragung im Zentralnervensystem ist für eine höhere Gehirnfunktion unerlässlich [1] [2].

Die dynamische Regulierung der Anzahl von GABA A Rs an Synapsen liefert einen Schlüsselmechanismus für die funktionelle Plastizität inhibitorischer Synapsen [7]. Kürzlich wurde gezeigt, dass Gephyrin einen großen Einfluss auf die erfahrungsabhängige Plastizität inhibitorischer Synapsen in vivo ausübt [8] [9].

Es wurde gezeigt, dass die Gephyrinphosphorylierung zur funktionellen Regulation von GABAergen Synapsen beiträgt [10] [11]. Die Phosphorylierung der Serinreste 268 und 270 moduliert die Dichte und Größe von Gephyrinclustern in Hippocampusneuronen und trägt somit zur synaptischen Plastizität bei. Über die Mechanismen, die die Assoziation von Gephyrin mit der postsynaptischen Membran steuern, ist jedoch wenig bekannt.

Die Lipidmodifikation von Proteinen dient als Hauptmechanismus zur Steuerung der zellulären Lokalisierung und Assoziation von Proteinen mit Membranen [12]. Insbesondere die reversible Palmitoylierung hat sich als häufigste Lipidmodifikation von synaptischen Proteinen herausgestellt, mit vielfältigen Auswirkungen auf den Proteinhandel, die neuronale Entwicklung und die synaptische Plastizität [13].

Die Palmitoylierung wurde am ausführlichsten im Zusammenhang mit Proteinen untersucht, die an exzitatorischen Synapsen funktionieren. Unter diesen wurde die reversible Palmitoylierung des Gerüstproteins PSD-95 mit der aktivitätsabhängigen Plastizität exzitatorischer Synapsen in Verbindung gebracht [14] [15].

Über die Rolle anderer palmitoylierter Substrate bei inhibitorischen Synapsen ist jedoch wenig bekannt. Ein kürzlich durchgeführter proteomischer Ansatz identifizierte Gephyrin als potenzielles palmitoyliertes Substrat an inhibitorischen Synapsen [19].

Hier bestätigen und erweitern wir diesen Befund. Insbesondere zeigen wir, dass Gephyrin in vivo palmitoyliert ist, was bestimmt, ob Gephyrin membrangebunden oder löslich ist und somit die Größe von postsynaptischen Gephyrinclustern reguliert. Funktionsstudien an Neuronen identifizierten DHHC-12 als primäre Palmitoyltransferase. Unsere Ergebnisse identifizieren die Palmitoylierung von Gephyrin als einen Schlüsselmechanismus, der der funktionellen Plastizität von GABAergen Synapsen zugrunde liegt. Wir führten eine auf Ultrazentrifugation basierende subzelluläre Fraktionierung von Maus-Hirnlysaten durch und fanden Gephyrin hauptsächlich in der Pelletfraktion, was zeigt, dass es hauptsächlich mit Membranen assoziiert ist (Abbildung 1a).

Waschmittelresistente Membranen DRMs bestehen hauptsächlich aus Cholesterin [20]. Bei der Solubilisierung von DRMs mit dem Cholesterinkomplexbildner Saponin schwebte Gephyrin nicht mehr in Saccharosegradienten, was darauf hinweist, dass es wahrscheinlich lipidmodifiziert ist.

Zehn Fraktionen wurden von oben nach unten entnommen. Die Spuren der oberen Platte wurden aus derselben Membran gespleißt. Das Experiment wurde mit zwei einzelnen synaptosomalen Präparaten mit im wesentlichen den gleichen Ergebnissen durchgeführt. Die Proteinpalmitoylierung ist an der Ausrichtung von Proteinen auf DRMs beteiligt [21]. Die metabolische Markierung von Gephyrin-exprimierenden Sf9-Zellen mit dem Palmitatanalogon 17-Octadecinsäure 17-ODYA, gefolgt von der Anwendung der Klick-Chemie und der Affinitätsreinigung, ergab eine deutliche Gephyrin-Palmitoylierung. Abbildung 1c.

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass natives neuronales Gephyrin palmitoyliert ist, wie durch Acyl-Biotin-Austausch-ABE-Assays von kultivierten Hippocampus-Neuronen gezeigt wurde (Abbildung 1d). Um die subzelluläre Lokalisation von palmitoyliertem Gephyrin zu bestimmen, fraktionierten wir rohe Gehirnhomogenate in mit Synaptosomen angereicherte und cytosolische Fraktionen, passten das Probenvolumen an, um ähnliche Mengen an Gephyrin zu verarbeiten, und führten ABE-Assays durch (Abbildung 1e). Ähnlich wie bei PSD-95 wurde festgestellt, dass Gephyrin hauptsächlich in der synaptosomalen Fraktion palmitoyliert ist, was darauf hinweist, dass es an Synapsen lipidmodifiziert ist.

Als nächstes untersuchten wir die Rolle der Gephyrin-Palmitoylierung hinsichtlich ihrer Lokalisierung und Clusterbildung an inhibitorischen Synapsen. Die Co-Immunfärbung von Hippocampus-Neuronen bei 14 DIV zeigte eine Co-Lokalisierung der Gephyrin-Cluster-Immunreaktivität mit der punktuellen Immunreaktivität für den präsynaptischen terminalen Marker vesikulär, GABA-Transporter VGAT, an, 2a. In Kontrollneuronen wurden Gephyrincluster weitgehend mit VGAT kolokalisiert, während bei Hemmung der Palmitoylierung mit 2-BP häufig eine nicht-synaptische Kontrolle von Gephyrinclustern beobachtet wurde, 90.

Obwohl die Größe der Gephyrin-Cluster signifikant reduziert wurde 70. Pfeile zeigen auf nicht-synaptische Gephyrin-Cluster bei Inkubation mit 2-BP. Immunoblots mit zunehmenden Volumina von ABE-Assay-verarbeiteten Proteinlysaten wurden verwendet, um eine Bandenintensitäts-Standardkurve für ABE-Assay-Eluate von Gephyrin und PSD-95 zu erstellen. Das Experiment wurde mit drei Gehirnen durchgeführt. Da Gephyrin-Oligomere, die wir zuvor als Hexamere und Nonamere charakterisiert hatten, als stabile und individuelle Einheiten zu fungieren scheinen [22], haben wir uns gefragt, wie viel Gephyrin in Neuronen palmitoyliert ist.

Daher wurden zunehmende Mengen an Lysat vor der Affinitätsreinigung von ABE-verarbeiteten Gehirnproben entnommen und zusammen mit affinitätsgereinigten Perleneluaten durch Western Blot quantifiziert.

Die Quantifizierung der Bandenintensitäten ergab, dass 7. Gephyrin eine modulare Struktur aufweist, die aus einer N-terminalen G-, einer zentralen C- und einer C-terminalen E-Domäne besteht [23]. Um funktionell relevante Reste in Gephyrin zu identifizieren, die palmitoyliert sind, konzentrierten wir uns auf oberflächenexponierte Cysteinreste in der G- und E-Domäne [24] [25] und die drei Cys-Reste in der C-Domäne. Dies reduzierte die Anzahl potenziell palmitoylierter Reste von 12 auf 8 Abbildung 3a.

Um zu bestätigen, dass Cys212 und 284 palmitoyliert sind, führten wir eine Massenspektrometrieanalyse von ABE-verarbeitetem Gephyrin durch, das in Sf9-Zellen exprimiert wurde. Wir identifizierten Biotineinheiten selektiv auf Cys212- und Cys284-haltigen Peptiden (Abbildung 3c). Streptavidin-HRP zeigt den Palmitoylierungsstatus einzelner Varianten, während GFP-Immunoblot als Beladungskontrolle verwendet wurde.

Das Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Pro Experiment wurden mindestens drei unabhängige Kulturen verwendet. Als nächstes verglichen wir die synaptischen Clustering-Eigenschaften der acht GFP-markierten Cystein-Serin-Gephyrin-Varianten und eines Wildtyp-WT-Konstrukts in transfizierten primären Hippocampus-Neuronen. Unter den acht Mutantenvarianten zeigten nur 212Geph und 284Geph eine signifikante Abnahme der Gephyrinclustergrößen, und die Wirkung dieser Mutationen war in der 212,284Geph-Variante 212Geph, 68, additiv.

Alle anderen Varianten waren vom WT-Gephyrin-Konstrukt nicht zu unterscheiden (Abbildung 3d). Die Gesamtfluoreszenz von 212.284Geph-Clustern war signifikant auf 41 reduziert. Die Tatsache, dass die Clustergröße von 212.284Geph durch 2-BP-Behandlung 58 nicht weiter verringert wurde sowohl in synaptisch als auch in nicht-synaptisch lokalisierten Clustern akkumuliert Abbildung 4a - c.

Zusätzlich zeigten 212.284Geph-exprimierende Neuronen eine signifikant erhöhte Clusterdichte im Vergleich zu Gephyrin-GFP-transfizierten Kontrollen Gephyrin-GFP, 3. Für die Quantifizierungen wurden mindestens drei unabhängige Kulturen verwendet.

Wir stellten die Hypothese auf, dass falsch lokalisierte, nicht synaptische Gephyrincluster nicht mit der postsynaptischen Membran assoziiert waren und sich stattdessen in der löslichen Fraktion angesammelt hatten.

Um diese Idee zu testen, fraktionierten wir 2-BP-behandelte und kontrollierte primäre Neuronenhomogenate in lösliche cytosolische und membrangebundene Fraktionen. Im Vergleich zu Kontrollkulturen, in denen Gephyrin hauptsächlich im unlöslichen Pellet gefunden wurde, zeigten 2-BP-inkubierte Kulturen Gephyrin, das mit der Überstandsfraktion angereichert war (Abbildung 4f). Zusätzlich quantifizierten wir das Verhältnis von geclustertem zu cytoplasmatischem Gephyrin in Gephyrin-GFP- und 212.284Geph-transfizierten Neuronen durch Linienscan-Analysen konfokaler mikroskopischer Aufnahmen.

Wir schließen daraus, dass die Palmitoylierung von Gephyrin für die postsynaptische Clusterbildung in Neuronen wesentlich ist. Als nächstes wollten wir die primären Gephyrin-Palmitoylierungsenzyme identifizieren. Wir fanden heraus, dass die Palmitoylierung von Gephyrin bei gleichzeitiger Expression mehrerer DHHC-Enzyme zunahm, wobei die stärksten Anstiege bei DHHC-12, -16, -17 und -18 zu beobachten waren (Abbildung 5a).

Beachten Sie, dass die Steady-State-Expressionsniveaus der verschiedenen transfizierten DHHCs ungleichmäßig waren (Abbildung S4b), wie auch von anderen berichtet wurde [28] [29]. Das Weglassen von Hydroxylamin zeigte nachweislich die Spezifikation des Assays. Im Histogramm sind DHHC-Enzyme gemäß [16] markiert.

Als Kontrolle wurde ein Plasmid verwendet, das das jeweilige dhhc-Gen codiert. Da das ungleichmäßige Expressionsmuster die Bedeutung einiger DHHCs falsch darstellen und die Ergebnisse in einer physiologisch relevanteren Umgebung validieren könnte, führten wir zusätzlich ein DHHC-Screening in primären Hippocampus-Neuronen durch. Im Gegensatz dazu wurde die Dichte der Gephyrincluster nicht beeinflusst (Abbildung 5d). Umgekehrt führte die Coexpression von Gephyrin-GFP mit einem dominant-negativen DHH S -12-Konstrukt, das für bicistronische mCherry kodiert, um transfizierte Dendriten sichtbar zu machen, zu signifikant kleineren Gephyrinclustern im Vergleich zu Kontrollen, die nur mit mCherry transfiziert wurden 70.

Ähnlich wie bei Gephyrin mit Palmitoylierungsmangel war die Gephyrin-GFP-Clusterdichte in Gegenwart der DHHS-12-Kontrolle signifikant erhöht. 5. Endogene Transkripte von DHHC-12 waren in kultivierten Neuronen leicht nachweisbar, was mit der Relevanz für die Palmitoylierung neuronaler Proteine ​​übereinstimmt (Abbildung 5i). Somit legen die Daten nahe, dass die Gephyrin-Palmitoylierung den postsynaptischen GABA A R-Pool in Übereinstimmung mit der erhöhten Größe der postsynaptischen Gephyrin-Cluster bei DHHC-12-Expression erhöhte.

Die Anzahl der quantifizierten Ereignisse oder Neuronen ist in Klammern angegeben. Um festzustellen, in welchem ​​neuronalen Zellkompartiment Gephyrin palmitoyliert wird, untersuchten wir als nächstes die subzelluläre Lokalisation von DHHC-12 und führten eine Immunfluoreszenzfärbung von primär kultivierten Neuronen durch, die mit HA-markiertem DHHC-12 transfiziert waren. Die Immunreaktivität von DHHC-12-HA zeigte eine signifikante Überlappung mit der Färbung des Golgi-Marker-Riesenins, was darauf hindeutet, dass das Enzym weitgehend im Golgi lokalisiert ist (Abbildung 7a).

Zusätzlich zum Soma akkumulierte DHHC-12-HA in primären Dendriten mit einem Färbungsmuster, was auf seine Anwesenheit in vesikulären Golgi-Außenposten hinweist (Abbildung 7a). Die höhere Vergrößerung unten zeigt die Golgi-Lokalisierung von DHHC-12 im Zellkörper und in Dendriten als vesikelartige Strukturen.

Interessanterweise wurden PLA-Punkte hauptsächlich in nicht-synaptischen Regionen gefunden, was durch die Nähe, aber nicht überlappende Lokalisierung von PLA-Punkten und Gephyrin-Clustern angezeigt wird.

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