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Eluierende DNA von Whatman-Papier 3mm

Nukleinsäurereinigung aus Pflanzen, Tieren und Mikroben in weniger als 30 Sekunden. PLOS Biology 16 5: Die Nukleinsäureamplifikation ist ein leistungsfähiges molekularbiologisches Instrument, obwohl ihre Verwendung außerhalb der modernen Laborumgebung aufgrund der relativ umständlichen Methoden zur Extraktion von Nukleinsäuren aus biologischen Proben begrenzt ist. Um dieses Problem anzugehen, untersuchten wir eine Vielzahl von Materialien auf ihre Eignung zum Einfangen und Reinigen von Nukleinsäuren. Wir berichten hier, dass unbehandeltes Papier auf Cellulosebasis Nukleinsäuren innerhalb von Sekunden schnell einfangen und während eines einzelnen Waschschritts zurückhalten kann, während in komplexen biologischen Proben vorhandene Verunreinigungen schnell entfernt werden.

Aufbauend auf diesem Wissen haben wir erfolgreich eine ausrüstungsfreie Nukleinsäureextraktionsmessstabmethode entwickelt, mit der amplifikationsbereite DNA und RNA von Pflanzen, Tieren und Mikroben aus schwierigen biologischen Proben wie Blut und Blättern von erwachsenen Bäumen in weniger als 30 Jahren gewonnen werden können Sekunden. Die Einfachheit und Geschwindigkeit dieses Verfahrens sowie die geringen Kosten und die Verfügbarkeit geeigneter Materialien e.

In Kombination mit den jüngsten Fortschritten bei der isothermen Amplifikation und DNA-Visualisierungstechniken mit bloßem Auge ermöglicht die Teststreifen-Extraktionstechnologie die Durchführung molekulardiagnostischer Assays in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen, einschließlich Klassenzimmern von Universitäten und Gymnasien, feldbasierten Umgebungen und Entwicklungsländern.

Die Nukleinsäureamplifikation hat sich in Labors auf der ganzen Welt für eine Vielzahl von Anwendungen von der Diagnostik bis zur Genotypisierung als unverzichtbar erwiesen.

Der erste Schritt in jeder Anwendung, die auf die Amplifikation von DNA oder RNA abzielt, ist die Extraktion von Nukleinsäuren aus einer komplexen biologischen Probe; Eine Aufgabe, die traditionell spezielle Geräte, geschulte Techniker und mehrere Schritte zur Handhabung von Flüssigkeiten erfordert. Es ist diese Komplexität der gegenwärtigen Nukleinsäureisolierungsmethoden, die den Einsatz vieler DNA-Amplifikationstechnologien außerhalb der modernen Laborumgebung einschränkt.

Daher haben wir in dieser Studie neue Materialien und Ansätze untersucht, um die Nukleinsäureextraktion zu vereinfachen. Wir fanden heraus, dass Filterpapier auf Cellulosebasis verwendet werden kann, um Nukleinsäuren schnell zu binden, sie während eines kurzen Waschschritts zurückzuhalten, um Verunreinigungen zu entfernen, und sie dann direkt in die Amplifikationsreaktion zu eluieren.

Anschließend haben wir den Cellulosefilter angepasst, um einen Messstab zu erstellen, mit dem Nukleinsäuren aus einer Vielzahl von Pflanzen-, Tier- und Mikrobenproben in weniger als 30 Sekunden gereinigt werden können, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind. Die Geschwindigkeit und Einfachheit unserer Methode macht sie ideal für Anwendungen auf der Basis der Nukleinsäureamplifikation innerhalb und außerhalb des Labors geeignet, einschließlich begrenzter Ressourceneinstellungen wie abgelegener Standorte, Entwicklungsländer und Lehrinstitutionen.

PLoS Biol 15 11: Akademischer Herausgeber: 11. August 2017; Akzeptiert: 17. Oktober 2017; Veröffentlicht: 21. November 2017. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License verbreitet wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion auf jedem Medium ermöglicht, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben sind. Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten befinden sich im Papier und in den Hintergrundinformationsdateien.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen. Die Fähigkeit, spezifische DNA-Sequenzen zu amplifizieren und nachzuweisen, ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das routinemäßig für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet wird, einschließlich Krankheitsdiagnostik, qualitative QTL-Selektion von Trait Loci und Mutanten-Screening. In diagnostischen Anwendungen bietet die Analyse auf Nukleinsäurebasis viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden wie Assays auf Enzym- oder Antikörperbasis, die eine erhöhte Empfindlichkeit, schnellere Ergebnisse bei der Beantwortung von Proben und Flexibilität bieten, da sie schnell modifiziert werden kann, um neuen Herausforderungen gerecht zu werden entstehen [1].

Der größte Engpass, der die weit verbreitete Einführung der molekularen Diagnostik außerhalb der modernen Laborumgebung verhindert, ist jedoch die Anforderung, Nukleinsäuren aus Proben zu reinigen. Dies ist eine komplexe Aufgabe, die traditionell geschulte Techniker erfordert und viele Schritte zur Handhabung von Flüssigkeiten umfasst [2 - 4].

Die Forderung nach einfacheren und schnelleren Nukleinsäurereinigungsverfahren führte zur Erweiterung kommerziell erhältlicher Festphasenextraktionskits. Eine große Mehrheit dieser Kits basiert auf der Bindung von Nukleinsäuren an einen festen Siliciumdioxidträger in Gegenwart eines chaotropen Salzes [5 - 8]. Verunreinigungen werden dann durch eine Reihe von Wasch- und Zentrifugationsschritten entfernt, bevor schließlich die Nukleinsäuren in einer salzarmen Lösung aus der Kieselsäure eluiert werden. Kommerziell erhältliche paramagnetische Kügelchen mit einer Vielzahl unterschiedlicher funktionalisierter Oberflächenchemien zum Einfangen und Reinigen von Nukleinsäuren sind verfügbar geworden, sodass keine Zentrifugation erforderlich ist [9 - 11].

In diesen Systemen wird ein Magnet verwendet, um die paramagnetischen Perlen anzuziehen und an der Seite des Röhrchens zu halten, um die Entfernung des Überstands während der Wasch- und Elutionsschritte zu ermöglichen. Obwohl die Reinigung von Nukleinsäuren auf der Basis paramagnetischer Partikel ungefähr 10 Minuten relativ schnell ist und keine elektrische Ausrüstung erfordert, ist sie für Anwendungen, die außerhalb der modernen Laborumgebung durchgeführt werden, wie z. B. feldbasierte PON-Tests am Ort der Notwendigkeit, immer noch zu kompliziert.

Diese neuen Verfahren vereinfachten den Nukleinsäurereinigungsprozess, indem die Notwendigkeit eines separaten Nukleinsäure-Elutionsschritts durch direkte Amplifikation der Nukleinsäure von der Membran beseitigt wurde. Dies ist ein Vorteil gegenüber vielen anderen Festphasenextraktionstechniken, da entweder die Oberflächenchemie der Matrix oder die an sie gebundenen Restreagenzien e.

Trotz des Wegfalls des Elutionsschritts erfordern alle diese Verfahren eine relativ komplexe Herstellung oder Versuchsanordnung, mehrere Pipettierschritte oder elektrische Ausrüstung, um die Reinigung der Nukleinsäuren zu unterstützen, was wiederum ihre Nützlichkeit für feldbasierte Assays einschränkt.

Die DNA-Bindung auf Cellulosebasis ist ideal für die molekulare Diagnostik, da sie kostengünstig, tragbar, wegwerfbar und leicht zu modifizieren ist [20 - 22]. Aus diesem Grund haben wir uns vorgenommen, ein Nukleinsäurereinigungsverfahren unter Verwendung von Cellulosepapier zu entwickeln, das keine komplexe Herstellung oder spezielle Ausrüstung wie Pipetten und Zentrifugen erfordert.

Hier beschreiben wir eine einfache, ausrüstungsfreie Methode, mit der Nukleinsäuren aus einer Vielzahl von Pflanzen-, Tier- und Mikrobenproben innerhalb von weniger als 30 Sekunden gereinigt werden können und die daher gleichermaßen für Anwendungen auf Nukleinsäurebasis innerhalb und außerhalb der EU geeignet ist moderne Laborumgebung. Um eine einfache Nukleinsäurereinigungsmethode zu entwickeln, die keine modernen Laboreinrichtungen erfordert, haben wir zunächst die Fähigkeit einer Reihe kationischer Chemikalien untersucht, die möglicherweise dazu beitragen könnten, anionische DNA und RNA einzufangen, indem sie auf ein Stück Whatman No.

Wir fanden heraus, dass eine Reihe von Verbindungen, einschließlich Chitosan und Polyethylenimin-PEI, eine starke Fähigkeit zur Bindung von Nukleinsäuren S1A zeigten und weiter auf ihre Fähigkeit getestet wurden, genomische DNA einzufangen, die in einer PCR-Reaktion direkt aus der modifizierten Cellulose amplifiziert werden konnte.

In diesen Experimenten erzeugte keine der untersuchten chemischen Behandlungen eine reproduzierbare Amplifikation. Wir haben jedoch festgestellt, dass die Kontrolle, nicht modifizierte Whatman No.

Über die Fähigkeit von Papier auf Cellulosebasis, DNA unter bestimmten Bedingungen einzufangen oder zu adsorbieren, wurde ausführlich berichtet, ihre Verwendung war jedoch auf Lagerung oder Transport beschränkt und nicht für die Reinigung von Nukleinsäuren unter nicht ausfallenden Bedingungen [10, 11, 23 - 25]. Wir haben die Effizienz weiter untersucht, mit der Whatman No.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Whatman-Nr. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cellulose DNA effizient binden oder zumindest einschließen kann und die Amplifikationsreaktion nicht hemmt. Die mit Cellulosescheiben erreichten Bandenintensitäten relativ zur direkten DNA-Zugabe erscheinen unter jeder Bande. B Ein Überblick über das Nukleinsäurereinigungsverfahren unter Verwendung von Whatman Nr. Gewebe wird in einer 1 gemahlen. Nukleinsäuren werden mit einem Whatman Nr. 3 mm Durchmesser eingefangen.

Die Scheibe wird dann eine Minute lang in ein Röhrchen mit Waschpuffer überführt, um im Rohextrakt vorhandene Verunreinigungen zu entfernen, bevor sie in das Röhrchen mit der Amplifikationsreaktion überführt wird. Die PCR-Reaktion wird durchgeführt, ohne die Scheibe aus dem Röhrchen zu entfernen. C Whatman Nr. A Scheibe mit 7 mm 2 und 3 mm Durchmesser von Whatman Nr.

Die in der PCR verwendeten Primer wurden entworfen, um ein 262-bp-Fragment des Arabidopsis-G-Protein-Gamma-1-Untereinheit-Gens At3g63420 zu amplifizieren. Das kurze Waschen des mit Extrakt getränkten Filterpapiers einmal vor der Verwendung des Filters direkt in einer PCR-Reaktion war jedoch ausreichend, um Amplifikationsinhibitoren zu entfernen, während die eingefangene Pflanzen-DNA 1C erhalten blieb.

Das Durchführen eines zweiten Waschvorgangs verbesserte oder verringerte die Amplifikationseffizienz nicht. Obwohl die Methode erfolgreich auf die Modellpflanzenart A angewendet wurde, haben wir unsere auf Cellulose basierende DNA-Reinigungsmethode erfolgreich auf eine Reihe landwirtschaftlich wichtiger Arten angewendet, darunter Weizen, kaum Reis, Sojabohnen, Tomaten und Zuckerrohr. Abb. 2A.

Das Verfahren wurde auch erfolgreich verwendet, um PCR-fähige DNA aus reifen Blättern einer Reihe von Zitrusbaumarten, Mandarine, Limette und Zitrone, herzustellen. und Polysaccharide [26]. Eine genomische DNA aus Blattgeweben wurde unter Verwendung des Cellulosescheiben-Nukleinsäurereinigungsverfahrens extrahiert.

Universalprimer, die gegen die genomische DNA von 5. gereinigten Hela-Zellen entwickelt wurden, wurden als positive Kontrolle verwendet. Wichtige menschliche Krankheiten wie HIV und Hepatitis können mithilfe von Nukleinsäure-basierten Tests aus Blutproben diagnostiziert werden, obwohl es wichtig ist, vor der DNA-Amplifikation mehrere hemmende Verbindungen zu entfernen [27].

Beispielsweise werden Reagenzien wie Proteinase K verwendet, um die Effizienz der DNA-Extraktion zu erhöhen, können jedoch selbst die DNA-Amplifikation hemmen. Es gibt sowohl kommerzielle Kits als auch veröffentlichte Methoden, mit denen DNA aus Blut extrahiert werden kann. Sie erfordern jedoch eine relativ umfangreiche Probenmanipulation, wodurch sie für PON-Anwendungen und andere Umgebungen mit begrenzten Ressourcen suboptimal sind. E. Die direkte Zugabe der Probe zur PCR-Reaktion führte zu keiner nachweisbaren Amplifikation. Im Gegensatz dazu ermöglichte das Eintauchen des Filterpapiers in die Probe, gefolgt von einem einminütigen Waschen, eine Amplifikation, während hemmende Verbindungen aus der Probe entfernt wurden, was zu einem klaren Amplifikationsprodukt führte.

Das Cellulosescheibenverfahren wurde auch erfolgreich verwendet, um genomische DNA aus Melanomzelllinienkulturen zu amplifizieren, während die direkte Zugabe von Lysat zum PCR-Reaktionsgemisch keine Amplikons erzeugte (Fig. 2C).

Unserer Meinung nach besteht eine der ultimativen Anwendungen für unsere Methode in molekulardiagnostischen Tests am PON außerhalb des modernen Labors, die die derzeitigen arbeitsintensiven Verfahren ersetzen. Um die Fähigkeit der Methode zum Nachweis von Pflanzenpathogenen zu testen, infizierten wir Arabidopsis-Pflanzen mit dem bakteriellen Pathogen Pseudomonas syringae. Unsere Methode extrahierte und amplifizierte erfolgreich pathogene DNA, noch bevor die Symptome für das menschliche Auge sichtbar waren.

Da die Größe der Cellulosescheibe und das Verhältnis von Gewebe zu Extraktionspuffer zwischen den Proben konstant gehalten wurden, konnte das Fortschreiten der Krankheit durch PCR quantifiziert werden, wenn die Bandenintensitäten mit zunehmender Schwere der Krankheit zunehmen. Das Cellulosescheibenverfahren wurde auch erfolgreich beim Nachweis eines tierischen bakteriellen Pathogens, Actinobacillus pleuropneumoniae, in einem Lungenabstrich eines infizierten Schweins verwendet.

Schließlich haben wir getestet, ob die Methode zur Extraktion von RNA verwendet werden kann, da viele pflanzliche und tierische Krankheitserreger RNA-Genome aufweisen. Mit dem Gurkenmosaikvirus CMV infizierte Tomatenpflanzen wurden unter Verwendung der Filterpapier-DNA-Extraktionsmethode ohne Modifikationen getestet.

In diesem Fall verwendeten wir die RPA-Isotherme der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation unter Zugabe von reverser Transkriptase zum Reaktionsgemisch, um die reverse Transkription und Amplifikation gleichzeitig in einem einzigen Röhrchen durchzuführen. Ein Amplifikationsprodukt wurde bei Reaktionen erhalten, die reverse Transkriptase enthielten, während bei nicht infizierten Proben oder Reaktionen ohne reverse Transkriptase keine Amplifikation beobachtet wurde. Fig. 3C.

Das Cellulosescheibenverfahren funktioniert auch in Verbindung mit anderen isothermen Verfahren, einschließlich der durch Schleifen vermittelten Amplifikations-LAMP, die die CMV-RNA aufgrund der intrinsischen reversen Transkriptaseaktivität des Bst 2 nachweisen, ohne dass eine reverse Transkriptase erforderlich ist.

Eine DNA wurde aus P gereinigt. Die mit Cellulosescheiben relativ zur Positivkontrolle erreichten Bandenintensitäten erscheinen unter jeder Bande. B A Whatman Nr. D Cellulosescheiben wurden verwendet, um Nukleinsäuren aus Tomatenpflanzen zu reinigen, die entweder gesund oder mit Gurkenmosaikvirus infiziert waren, und sie anschließend in einer isothermen LAMP-Reaktion zu amplifizieren.

Es können jedoch nicht alle Cellulosepapiere verwendet werden, um Nukleinsäuren zu reinigen, da übliches Fotokopierpapier, entweder gebleicht oder ungebleicht, ein Produkt nicht amplifizieren konnte. Wir haben erfolgreich Nylonmembranen Qiagen Qiabrane, Amersham Hybond-N verwendet, um DNA aus dem Pflanzenextrakt zu reinigen, was zeigt, dass diese Methode nicht auf Träger auf Cellulosebasis beschränkt ist.

Dieses Ergebnis zeigt, dass Materialien, die für die DNA-Erfassung ideal sind, für die Verwendung bei der DNA-Amplifikation nicht unbedingt geeignet sind. Wir haben festgestellt, ob die Menge der bei der DNA-Extraktion verwendeten Cellulose einen Einfluss auf die Amplifikationsausbeute hat.

Nach Verwendung von 1, 2 oder 3 Scheiben im Extraktionsverfahren beobachteten wir eine umgekehrte Beziehung zwischen der Anzahl der verwendeten Cellulose- oder Nylonscheiben und der Menge der amplifizierten DNA. Es ist plausibel, dass zunehmende Mengen an Cellulose zu einer stärkeren Sequestrierung von Primern, Desoxynukleotidtriphosphat-dNTPs oder anderen Reagenzien in der Amplifikationsreaktion führen können. Wir stellten die Hypothese auf, dass der Mechanismus, der unserer Schnellreinigungsmethode zugrunde liegt, auf Unterschieden in der Kinetik der Bindung und Freisetzung von Nukleinsäuren an die Cellulose beruht.

In unserem Modell können Nukleinsäuren schnell an die Cellulosefasern binden, werden jedoch viel langsamer freigesetzt. Bemerkenswerterweise binden andere in den Probenextrakten vorhandene Komponenten, wie Amplifikationsinhibitoren, entweder nicht an die Cellulose oder werden während des kurzen Waschschritts schnell freigesetzt und anschließend aus der Cellulosematrix entfernt.

Im Gegensatz dazu fanden wir während des Waschschritts, dass DNA mit einer relativ langsamen Geschwindigkeit aus der Cellulose freigesetzt wurde (4B). Whatman Nr. Wie erwartet ergab die Scheibe, die nicht gewaschen wurde und daher die gesamte DNA-Probe enthielt, nach der Amplifikation die höchste Bandenintensität. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese, Whatman No.

Am wichtigsten ist, dass ein kurzes einminütiges Waschen die im Filter zurückgehaltene DNA-Menge nicht stark beeinflusste, wie aus der ähnlichen Intensität der Amplifikationsbanden im Vergleich zur Kontrolle ohne Waschen ersichtlich ist.

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